O białkach skrótowo - część 1

O białkach skrótowo - część 1
Ubiegłoroczna Nagroda Nobla z dziedziny chemii została przyznana za taką modyfikację mikroskopii elektronowej, aby było możliwe obrazowanie tą metodą białek. Choć werdykt Komitetu Noblowskiego był kontrowersyjny, a mikroskopia elektronowa stanowi raczej dziedzinę fizyki, to jednak o białkach chemik powinien wiedzieć więcej niż inni.

Białka to prawdziwy temat-rzeka - nawet gdyby poświecić im cały numer "Młodego Technika", nie byłoby możliwe przedstawienie zagadnień budowy, funkcji, historii i współczesności badań. Dlatego proszę o potraktowanie tego artykułu jedynie jako bardzo skrótowego przedstawienia unikatowej grupy związków organicznych.

 

Życie jest formą istnienia białka

"Sędziwi technicy" w tytule niniejszego rozdziału rozpoznają fragment tekstu Agnieszki Osieckiej - najpierw śpiewany jako "Lekcja fizyki", a potem jako przebój Skaldów "Nie ma szatana". Choć w komórce rządzą kwasy nukleinowe, to jednak nie ma przesady w twierdzeniu, że białko = życie. DNA w jądrze komórkowym można porównać do mózgu, RNA - do rąk, a wytwarzane przez ten ostatni związek białka - do wyspecjalizowanych narzędzi oraz opakowania dla kwasów. Białka to zatem:

  • budulec (keratyna skóry czy kolagen tkanki łącznej),
  • transport (hemoglobina krwi),
  • magazynowanie (ferrytyna przechowująca zapasy żelaza),
  • ruch (miozyna mięśni),
  • ochrona (przeciwciała),
  • regulacja (hormony),
  • reakcje chemiczne (enzymy).

O białkach każdy specjalista (biolog, dietetyk, lekarz) mógłby mówić bardzo długo, my jednak popatrzmy na nie (ilustracja na początku artykułu).

 

… oczami chemika.

Dla chemika białka to polimery (a właściwie polikondensaty, ponieważ podczas ich tworzenia wydziela się produkt uboczny - woda; pozostańmy jednak przy obiegowym określeniu związków złożonych z wielu mniejszych cząsteczek), zbudowane z aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi. O aminokwasach szczegółowo napiszę w przyszłym miesiącu, teraz tylko popatrzmy na schemat tworzenia wiązań pomiędzy nimi (R1 i R2 to fragmenty cząsteczek niebiorące udziału w reakcji):

Fragment znajdujący się w środku (-CO-NH-) to właśnie wiązanie peptydowe. Oba końce, zarówno z grupą aminową (N-koniec), jak i karboksylową (C-koniec), mogą brać udział w dalszych reakcjach, przedłużając cząsteczkę. Za białka uważane są łańcuchy zawierające co najmniej sto aminokwasów, mniejsze to peptyd.

Białka to molekuły o dużych rozmiarach, np. enzym heksokinaza (z prawej dla porównania cząsteczki ATP i glukozy).
Białka to molekuły o dużych rozmiarach, np. enzym heksokinaza (z prawej dla porównania cząsteczki ATP i glukozy).

 

W skład wszystkich aminokwasów wchodzą węgiel, wodór, tlen i azot. Te pierwiastki - oraz siarkę znajdującą się w metioninie i cysteinie - spotkamy we wszystkich białkach. Oprócz nich w minimalnych ilościach białka zawierają także fosfor i jony niektórych metali. Pierwiastki te nie pochodzą z aminokwasów, lecz z dodatkowych grup modyfikujących własności białek. Skład wagowy przeciętnego białka przedstawia się następująco: 53% węgla, 23% tlenu, 16% azotu, 7% wodoru i 1% siarki. Poszczególne białka wykazują oczywiście odchylenia od podanej średniej, czasem dość znaczne.

 

O wszystkim decyduje struktura

W procesie biosyntezy białka najpierw ze sobą łączą się aminokwasy, przy czym istotna jest ich kolejność. Dla przykładu: glicyna i alanina (w nawiasach znajdują się stosowane skróty nazw i wzorów) 

Dwa najprostsze aminokwasy białkowe - glicyna z lewej i alanina z prawej.
Dwa najprostsze aminokwasy białkowe - glicyna z lewej i alanina z prawej.

w reakcji nie utworzą jednego produktu, lecz dwa:

Zapisane pod wzorami skróty oznaczają, że w lewym związku N-końcem będzie glicyna, a C‑końcem - alanina (w prawym na odwrót). Oba związki mają różne właściwości: GA to nie to samo co AG (używając jednoliterowych oznaczeń). Dodając do tej pary trzeci aminokwas, np. walinę (Val lub V), powstaje już sześć połączeń: GAV, AGV, GVA, AVG, VGA, VAG (każdy z aminokwasów wzięty tylko jeden raz). Jeśli przypomnisz sobie, że w skład cząsteczki białka może wchodzić kilkaset, a nawet ponad tysiąc aminokwasów z kilkunastu różnych rodzajów, to zauważysz, że liczba możliwych do otrzymania związków jest iście astronomiczna - przekracza liczbę atomów we Wszechświecie, szacowaną na skromne 1080. Kolejność ułożenia aminokwasów w białku zwana jest jego sekwencją, czyli strukturą I-rzędową.

"Młody Technik" też ma swój peptyd: metionina (z lewej) połączona z treoniną - w skrócie Met-Thr lub MT.
"Młody Technik" też ma swój peptyd: metionina (z lewej) połączona z treoniną - w skrócie Met-Thr lub MT.

 

Model alfa-helisy białka (dla lepszego uwidocznienia struktury fragment zbudowany jest z glicyny i pominięto atomy wodoru).
Model alfa-helisy białka (dla lepszego uwidocznienia struktury fragment zbudowany jest z glicyny i pominięto atomy wodoru).

Żadne białko nie występuje w postaci prostego łańcucha aminokwasów. Łańcuchy ulegają skręceniu, a w wyniku tego procesu może powstać spirala (alfa-helisa), pofałdowana w harmonijkę kartka (beta-kartka) lub pętla (łańcuch aminokwasów skręca jak złożony na pół kabel). Powstałe struktury utrzymywane są w całości poprzez różnego rodzaju oddziaływania pomiędzy fragmentami cząsteczek aminokwasów, czasem dość odległych od siebie w łańcuchu. Skręcenie łańcucha to struktura II-rzędowa białka.

Ale na tym nie koniec. Skręcone łańcuchy aminokwasów ponownie splatają się ze sobą, tworząc konstrukcje przestrzenne. To właśnie ten stopień złożoności białek - struktura III‑rzędowa - decyduje przeważnie o ich właściwościach biologicznych. Pamiętajmy jednak, że jest to tylko pochodna sekwencji aminokwasów w łańcuchu. Jeśli w procesie biosyntezy wystąpi błąd (np. dojdzie do wstawienia niewłaściwego aminokwasu do szeregu), to łańcuch nie złoży się odpowiednio w strukturę II-rzędową, a ta potem nie utworzy struktury przestrzennej. Również mutacje genetyczne (czyli wadliwy przepis na kolejność aminokwasów) powodują zazwyczaj powstawanie nieczynnych lub szkodliwych biologicznie białek. Niektóre białka (np. hemoglobina) składają się z kilku oddzielnych struktur przestrzennych, mówimy wtedy o strukturze IV-rzędowej. Zarówno struktury III- jak i IV-rzędowe często zawierają składniki niebędące białkami - inne związki organiczne lub jony metali, które modyfikują ich kształt w sposób umożliwiający działanie. Wiele z tych dodatkowych składników to witaminy lub niezbędne składniki mineralne, stąd zrozumiały staje się ich wpływ na zdrowie człowieka (niedobór powoduje zablokowanie działania białek).

Białka występują w dwóch głównych rodzajach struktur przestrzennych. Pierwsza z nich to białka globularne, w przybliżeniu o kulistym kształcie. Są rozpuszczalne w wodzie i pełnią rolę enzymów, przeciwciał, hormonów i przenośników. Drugi rodzaj to białka fibrylarne o kształcie włókien. Są nierozpuszczalne w wodzie, a w organizmach stanowią budulec (skóra, narządy, struktury komórkowe, mięśnie). Siły wiązania odpowiedzialne za powstawanie poszczególnych rodzajów struktur słabną wraz ze wzrostem ich komplikacji. W przypadku struktury I-rzędowej są to zwykłe, mocne wiązania pomiędzy atomami, natomiast dla struktur najwyższych rzędów - bardzo słabe oddziaływania pomiędzy fragmentami cząsteczki. Dlatego dość łatwo je zerwać, pozbawiając białko czynności biologicznej.

 

Co niszczy enzym?

Pora na eksperyment. "Królikiem doświadczalnym" będzie białko katalaza, czyli jeden z enzymów. Katalaza rozkłada nadtlenek wodoru, a ponieważ występuje praktycznie u wszystkich organizmów żywych, nie będziesz miał trudności z jej zdobyciem. Obierz małego ziemniaka i utrzyj go na tarce. Masę ziemniaczaną zalej w naczyniu 100-200 cm3 zimnej wody i zamieszaj. Po opadnięciu osadu na dno, zlej ciecz znad niego i najlepiej od razu użyj jej do próby (gdy odkładasz eksperyment na później, wstaw roztwór do lodówki).

Przygotuj cztery probówki i ponumeruj je. Wlej do nich po 5-10 cm3 wyciągu z ziemniaka. Pierwszą pozostaw jako próbkę kontrolną, drugą ogrzewaj do wrzenia przez około minutę. Do jednej z pozostałych wlej 1-2 cm3 roztworu EDTA (kwas wersenowy lub jego sól sodowa), a do drugiej taką samą objętość rozpuszczalnej soli rtęci(II) lub ołowiu(II) o stężeniu ok. 5%.

Pamiętaj o zachowaniu szczególnej ostrożności podczas eksperymentowania ze związkami tych metali!

Probówki umieść w statywie, a następnie postaw go na tacy. Teraz do każdej z nich wlej 1-2 cm3 wody utlenionej (3% roztwór H2O2). W pierwszej probówce zachodzi burzliwa reakcja, a powstająca piana wypływa z naczynia (już chyba wiesz, dlaczego radziłem eksperymentować na tacy). Za to w pozostałych probówkach nie widać oznak reakcji.

Katalaza jest białkiem, więc wysoka temperatura spowodowała nieodwracalną zmianę struktury cząsteczki (po prostu białko się ugotowało) i utratę zdolności katalitycznych. EDTA połączyła się z obecnym w centrum enzymu jonem żelaza i w ten sposób zablokowała je - efekt jak wyżej. Z kolei jony metalu ciężkiego zmieniły strukturę całej cząsteczki, również powodując unieczynnienie enzymu. Nieodwracalna zmiana struktury białka powodująca utratę jego aktywności to denaturacja.

Jeśli nie chcesz wyciskać soku z ziemniaka (tak też otrzymasz roztwór katalazy) lub moczyć utartego kartofla w wodzie, również możesz przeprowadzić opisany eksperyment. Wybierz dużego ziemniaka i przekrój go na pół. Próby prowadź na oddalonych od siebie częściach bulwy. Jeden fragment przypiecz, przykładając rozgrzaną do czerwoności blaszkę stalową lub miedzianą. Wybrany fragment polej roztworem EDTA, a inny - soli metalu ciężkiego (ziemniak nie będzie nadawał się już do spożycia). Na powierzchnię nalej teraz wody utlenionej. Pienienie zaobserwujesz tylko we fragmencie, który nie był podgrzany, ani polany roztworami.

Doświadczenie z katalazą ziemniaka. W probówce 1 zachodzi burzliwy rozkład wody utlenionej. W probówkach 2 (zawartość wcześniej ogrzana do wrzenia), 3 (dodatek EDTA) i 4 (dodatek soli rtęci) brak oznak reakcji.
Doświadczenie z katalazą ziemniaka. W probówce 1 zachodzi burzliwy rozkład wody utlenionej. W probówkach 2 (zawartość wcześniej ogrzana do wrzenia), 3 (dodatek EDTA) i 4 (dodatek soli rtęci) brak oznak reakcji.

 

Denaturacja na fioletowo

Roztwór białka jaja (z lewej) i dodatni wynik próby biuretowej (z prawej).
Roztwór białka jaja (z lewej) i dodatni wynik próby biuretowej (z prawej).

Rozbij jajko i oddziel żółtko od białka. Łyżkę tego ostatniego rozpuść w połowie szklanki wody. Nalej 5-10 cm3 roztworu białka do probówki i dodaj kilka cm3 roztworu wodorotlenku sodu NaOH, a następnie błękitnej barwy roztworu siarczanu(VI) miedzi(II) CuSO4. W probówce powstaje fioletowe zabarwienie, a w przypadku większego stężenia białka - również „kluch” zdenaturowanej substancji organicznej. Wykonane doświadczenie to próba biuretowa.

Reakcja jest charakterystyczna dla białek i peptydów, a wykrywa obecność wiązań peptydowych położonych obok siebie i przedzielonych co najwyżej jednym atomem węgla. Powstaje wtedy związek kompleksowy miedzi(II) o fioletowej barwie. W przypadku małego stężenia białek nie dochodzi do wytrącenia osadu, ale tylko do zmiany barwy roztworu. Próbę wykorzystuje się m.in. w analityce medycznej do wykrywania białek w płynach ustrojowych (intensywność zabarwienia jest proporcjonalna do ich stężenia). Nazwa próby pochodzi od najprostszej budowy związku, który daje pozytywny wynik - biuretu. Jest to popularna nazwa dwumocznika (łac. bi = dwu, urea = mocznik), związku powstałego z kondensacji dwóch molekuł mocznika.

Temperatura i sole metali ciężkich to nie jedyne czynniki, które powodują denaturację białek. Nie jest zatem przesadą stwierdzenie, że z białkiem należy postępować jak z przysłowiowym jajkiem.